固定床生物反应器：基因治疗与疫苗产业病毒规模化生产的利器

随着基因治疗和细胞治疗技术从研究阶段加速发展至临床和商业化应用阶段，对于大规模病毒载体的需求量快速增加。传统的2D培养系统虽然可以在研究层面支持小规模病毒载体的生产，甚至可以支持体外实验的病毒载体用量，但是在商业化应用时还远远不够。

固定床生物反应器的核心由装有可以固定化细胞的膜耗材组成，当细胞流经细胞培养膜时会被膜材料捕获，并贴附在摸耗材中生长。和悬浮细胞培养系统相比，固定床反应器可以实现更高的细胞培养密度^[1]。

为了满足细胞扩增和病毒生产的需求，固定床生物反应器需要支持适当的介质流动，气体交换，热控制，pH和溶氧控制，还需要兼具可扩展性。CEL-G^® Culture Ad60系列固定床生物反应器（Ad60 FBR，图1）满足病毒生产的全部条件，该反应器的培养核心由一个装有紧凑3D聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）基质的可丢弃膜耗材组成，可以提供温和的低剪切环境用于细胞生长。

图1. CEL-G^® Culture Ad60系列固定床生物反应器

在Ad60 FBR中，细胞培养介质由PET膜和PP网紧密交替缠绕组成，形成了1㎡，2㎡，20㎡和60㎡等多个不同的培养面积选项。在进一步放大型的CEL-G^® Culture Ad600系列固定床生物反应器中，该培养面积最大可以放大到600㎡（图2）。

图2. CEL-G^® Culture Ad600系列固定床生物反应器

Ad60 FBR已经用于多种病毒载体的生产，最常用的载体类型是腺相关病毒，慢病毒和逆转录病毒，此外还生产了其他病毒，如狂犬病毒、溶瘤病毒、流感病毒、水痘带状疱疹，鼠白血病病毒等。

腺相关病毒（AAV）作为长期基因治疗工具，在固定床生物反应器中进行病毒生产已得到广泛应用，有研究表明，通过固定床进行的转染非常高效，平均转染效率达到97% ^[2]。使用 Ad60 FBR，在2㎡培养面积上，rAAV产量高达3.16×10¹⁴ vg/L。

目前，慢病毒载体和逆转录病毒载体的应用主要集中在体外治疗上。高昂的生产和制造成本，需要开发更高效的病毒和细胞产品的制造方法。固定床生物反应器为更经济有效的病毒制造提供了一种潜在的解决方案。尤其是对于不需要转染的包装细胞系生产的γ-逆转录病毒载体尤为简单。使用 Ad60 FBR，在2㎡培养面积生产慢病毒载体，单位面积产量高达9.8×10⁵TU/cm²。在进行γ逆转录病毒载体生产时，单位面积产量达到1.82×10⁹ cps/cm²。

此外， Ad60 FBR在其他病毒的生产上也取得了非常喜人的成果，在使用VERO生产II型溶瘤病毒时，产量达到了10⁷/CCID₅₀/ml，使用骨肉瘤细胞生产I型溶瘤病毒时，产量达到了1.3×10¹¹ PFU/ml，是传统2D培养的2.4倍。使用MDCK细胞生产流感病毒时，接毒30-40小时后，血球凝集实验测得的病毒稀释度达到640，远高于对照组病毒产量。

本文回顾了使用固定床生产病毒载体的可行性，并总结了使用固定床生产病毒载体的经典工艺流程，列举了当前使用Ad60 FBR在多种病毒载体生产上的案例和产量信息。证明了Ad60 FBR在病毒载体生产上的普适性和可靠性，是大规模生产病毒载体的理想选择。

[1] Bailey, J., Ollis D. (1986). Biochemical Engineerign Fundamentals. Second Edition. (Carberry J, Fair J, Peters M, Schowalter W, Wei J, eds.). McGraw-Hill Book Company.

[2] Powers, A.D., Piras, B.A., Clark, R.K., Lockey, T.D., Meagher, M.M. (2016). Development and Optimization of AAV hFIX Particles by Transient Transfection in an iCELLis ® Fixed-Bed Bioreactor. Hum Gene Ther Methods. 27(3):112-121.