同腾新创固定床生物反应器助力iMSC-EVs标准化生产和在肺纤维化治疗中的临床转化！

首先，研究人员从iPSCs经EPSCs、滋养层样干细胞(TLCs)最终分化为iMSCs（图2A）。通过流式细胞术分析（图2B），谱系特异性染色（图2C）及单细胞RNA测序分析（图2D），确认了iMSCs替代MSC来源的可行性及其功能和表型的一致性，表明iMSCs保留了原代MSCs的结构和功能特征。

图2. iMSC的生成、表征及其多向分化潜能

通过在P6、P8和P12代次的对比显微镜图像展示（图3A），三种MSC在整个传代过程中均保持典型的成纤维细胞样纺锤形态，未见明显衰老迹象或形态异常。流式细胞术分析（图3B）及核型分析（图3C）证明了其表型稳定性与基因组稳定性。CCK-8法测定（图3D）证实了它们在体外扩增过程中的持续增殖能力。这些发现表明，iMSCs不仅在较高传代时保持稳定的MSCs表型和核型，而且在表现出更大的基因组和表型稳定性的同时保持增殖能力。

图3. iMSC、UC-MSC与ADSC多次传代的稳定性表征

本研究使用CEL-G^® Culture Ad60构建了培养面积为 2 m²的固定床生物反应器系统，用于实现MSCs与iMSCs来源细胞EVs的高效生产。该工作流程整合了冻存工作细胞库、固定床反应器细胞接种、EVs上清液的连续收集，以及后续的切向流过滤纯化系统（图4A）。在接种后的第7天和第14天从反应器中取取样条，对MSCs与iMSCs取样条进行结晶紫染色观察（图4B），显示随时间推移细胞逐步增殖并覆盖膜材。通过活死细胞染色（图4C），显示两种细胞均呈现高存活率与极低死亡率，表明固定床生物反应器内培养环境稳定。流式细胞术分析（图4D）证实了iMSCs及MSCs表型在整个扩增过程中保持稳定。同时，测量了从生物反应器收集的上清液的日体积和纯化EVs的产量（图4E）。研究人员每天从MSCs和iMSCs的固定床培养体系中收获约600-700 mL的条件培养基，两组之间没有显著差异。切向流过滤后，将该体积浓缩至50-60 mL，得到相当的EVs悬浮液。纳米颗粒追踪（图4F）显示，MSCs的日产量约为1.5×10¹³ particles，iMSCs的日产量为1.2×10¹³ particles，证实了这两种细胞源具有等效的EVs生产能力。

图4. 利用Ad60 FBR系统实现MSC与iMSC来源细胞EVs的规模化生产及特性分析

通过测量骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中促炎细胞因子的表达来评估iMSC EVs和MSC EVs的促炎潜力。巨噬细胞分别经iMSC-EVs、MSC-EVs或LPS（阳性对照）处理4小时后，通过qRT-PCR分析TNFα、IL1β和IL6的mRNA表达水平（图5A）。结果显示，iMSC EVs和MSC EVs均未诱导显著的细胞因子表达，这表明这两种EVs类型都缺乏促炎活性。为了评估EVs的抗炎潜力，巨噬细胞先经iMSC-EVs或MSC-EVs预处理2天，再接受LPS刺激，随后通过qRT-PCR分析炎症因子表达（图5B）。结果显示，这两种EVs类型都表现出抗炎特性，支持了它们对炎症和免疫相关疾病的治疗潜力。

研究人员进一步在体内评估了iMSC EVs和MSC EVs的系统安全性。

小鼠于第0、2、4、6、8、10天经静脉注射iMSC-EVs或MSC-EVs（10¹¹ particles/dose），第13天处死进行安全性评估（图5C）。小鼠体重监测（图5D）、肝功能指标水平检测（图5E、F）及主要器官组织病理学分析（图5G）均证明iMSC EVs和MSC EVs是安全的，不会在体外引发炎症反应或在体内引起不良反应。此外，这两种EVs类型都表现出抗炎特性。这些发现突显了EVs作为免疫相关和炎症性疾病治疗剂的潜力。

图5. iMSC-EVs与MSC-EVs的免疫调节效应及系统安全性评估