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Ad60 FBR-AirFlow实现293F悬浮细胞固定化培养和外泌体高效连续生产
发布日期：2025-09-25
外泌体（exosome）是由细胞内多囊泡体(multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后，以出芽形式释放到细胞外基质中的双层膜囊泡小体。其直径通常在30-150nm之间，内部包裹有蛋白、脂类、mRNA和micro RNA等多种成分。
图1. 外泌体标志物和内含物示意图
外泌体能够携带蛋白质或遗传物质等分子载荷在细胞间运输。通过这种机制，它们能调控细胞通讯、免疫调节过程、肿瘤代谢以及再生/退行性病变进程。近年来，外泌体因其作为治疗和诊断工具的应用价值而备受关注。
随着工业级外泌体生产需求的持续增长，需要开发规模化的生产工艺。相较于传统2D培养平台，生物反应器凭借可控的生长环境调控能力和更大的操作空间优势，在工艺开发中展现出显著优势。这些特性使其成为实现外泌体规模化、可重复性生产的重要工具。
机械搅拌式悬浮生物反应器因为其在细胞培养方面的广泛应用，是大分子蛋白生产的常用平台。该反应器可以将细胞培养至较高密度，从而稳定的生产细胞衍生物，培养结束后，上清原液通过离心和浓缩纯化，可以得到纯度较高的产物。
然而，较短的培养周期、相对低效的单细胞生产效率以及充斥上清原液的过量杂质，让悬浮反应器在外泌体生产上投入产出比相对较低。为了延长培养周期，实现外泌体的连续式培养，灌流工艺被开发了出来。
传统的灌流工艺是在机械搅拌式悬浮反应器的基础上开发而来，增加了切向流过滤系统，细胞被截留在反应器内，培养上清原液通过切向流过滤系统排出反应器，并源源不断地向反应器中添加新的培养基。但是复杂的生产工艺，高控制难度，高硬件投资和运营成本，高污染风险限制了灌流工艺在生产外泌体方面的应用。
灌流反应器系统和将培养细胞固定在培养介质中的固定床生物反应器有非常大的相似之处，使用固定床反应器代替灌流反应器对悬浮细胞进行培养，在反应器结构和原理上都具有可实现基础。
图2. 灌流反应器和固定床反应器示意图
表1. ATF/TFF灌流工艺、补料工艺和固定床工艺对比
同腾新创CEL-G® Culture Ad60系列
固定床生物反应器和AirFlow系列新结构
同腾新创开发的CEL-G® Culture Ad60系列固定床生物反应器（AD60 FBR），采用独特的瀑布流设计，让固定床具备更小的剪切力，对贴壁细胞和悬浮细胞均可以提供更加温和的细胞培养环境。
图3. CEL-G® Culture Ad60 FBR
最新推出的AirFlow系列固定床进一步优化流体动力学，显著提升细胞扩增效率。前期已发布的案例中验证了AirFlow系列固定床可实现HEK293T高效扩增和细胞收获工艺，及HEK293T细胞在Ad60 FBR-AirFlow固定床中无血清培养和外泌体收获工艺，本研究基于AirFlow平台，首次验证293F悬浮细胞无血清固定化培养和外泌体收获工艺，旨在为293F来源外泌体的临床级生产提供可放大、可重复的解决方案。
表2. 同腾新创Ad60 FBR经典款和AirFlow系列固定床载体类型及应用领域
为了对比Ad60 FBR和搅拌式悬浮反应器在使用悬浮细胞生产外泌体上的效果，我们使用Ad60 FBR的AirFlow FB-1R（1㎡）固定床和applikon my-control （1.5L）悬浮反应器培养293F细胞。实验采用同一批次的悬浮培养基，悬浮反应器采用批次补糖模式，至细胞活率低于80%时收获上清。固定床采用批次模式，Day13时停止培养，分别在Day4/Day6/Day8/Day10/Day11/Day12/Day13收获上清。对细胞扩增、代谢数据、上清外泌体检测结果进行对比。
图4. 293F细胞在悬浮和固定床上的细胞扩增曲线
图5. 293F细胞在悬浮和固定床上的糖代谢曲线
图6. 293F细胞在悬浮和固定床上的乳酸代谢曲线
表3. 外泌体收获数据统计
图7. 固定床和悬浮反应器外泌体产量对比
图8. 固定床和悬浮反应器单位细胞外泌体产量对比
图9. 固定床和悬浮反应器外泌体粒径分布对比
实验结果表明，293F细胞在固定床中可以进行扩增培养，且固定床生物反应器具有悬浮反应器无法比拟的优势，即采用类似灌流的方式重复多次收获上清，减少代谢废物累积的同时，增加了外泌体产量，并可显著延长细胞培养周期。
从表3，图7和图8可以看出，悬浮反应器在day7时终止培养，仅收获了6.45E+13 particles的外泌体，而固定床生物反应器培养时间被延长到了13天，累积收获外泌体3.258E+14 particles，是悬浮反应器产量的5倍。且还有继续进行培养的潜力，可收获更多批次的上清。
从单细胞产量上看，固定床生物反应器单细胞外泌体产量也明显优于悬浮反应器，说明293F细胞在固定床生物反应器中拥有更高的外泌体生产效率。
此外，在收获的外泌体质量上，固定床生物反应器收获的外泌体明显优于悬浮反应器。从图9可以看出，上清产物中，30-150nm粒径范围的颗粒，固定床占比平均在95%以上，且粒径分布集中，而悬浮反应器终产物中该占比仅为65.1%，且粒径分布弥散，可能是较长时间处于悬浮搅拌环境中收到剪切力影响较大造成的颗粒均一性差。
因此，使用同腾新创Ad60 FBR搭配AirFlow系列载体固定化培养悬浮细胞生产外泌体具有可行性，且通过固定床生物反应器获得的外泌体在总产量、外泌体质量上均优于悬浮反应器。
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