案例应用丨临床规模外泌体质量研究及同腾CEL-G®外泌体平台实践

电镜验证：透射电镜（TEM）和冷冻电镜（Cryo-EM）显示，EVs呈典型的“圆形”结构（图1），形态均一。

图1、通过透射电子显微镜（TEM）（左图）和冷冻电镜（右图）获取EVs的电子显微镜图像

粒径分布：纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，外泌体平均粒径158.17±3.75 nm，模式粒径147.83±6.24 nm（图2），符合EVs的纳米级特征。

图2、使用NanoSight技术获得的EVs大小分布图

通过纳米流式细胞术（nanoFCM）检测：用膜特异性染料CMG标记后，94.9%的颗粒被染色；加入去垢剂Triton X-100裂解后，97.9%的颗粒被破坏，这说明95%以上的颗粒是真正的EVs（图3），杂质极少！

图3、使用膜特异性CMG染料标记的EVs，在TX-100处理前后，通过纳米颗粒流式细胞术（nFCM）进行了分析。CMG标记的EVs的代表性点图和粒径分布图（上图），以及TX-100处理后的结果（下图）。

EVs表面需携带特定标志物以证明“出身”。研究用多重磁珠流式分析（MACSPlex）检测发现：

MSC来源标记（CD29、CD44、CD105）阳性；EVs核心标记（CD9、CD63、CD81）阳性（图4），双重验证了MSC-EVs的“正宗身份”。

图4、使用多路珠基流式细胞术对EVs 表面标志物进行表达谱分析。显示了CD9/CD63/CD81 -APC检测后的EV表面标志物组成。

工艺杂质：培养基中的庆大霉素、牛血清白蛋白（BSA）未检出（图5）；

细胞成分残留：内质网（钙连蛋白）、细胞核（组蛋白）、高尔基体（GM130）、线粒体（细胞色素C）等细胞器标志物均未检出（图5）；

图5、评估EVs中存在的杂质。使用ELISA试剂盒分析了工艺相关性杂质（上图），包括庆大霉素和牛血清白蛋白（BSA）。通过ELISA试剂盒检查了细胞器标志物，如钙连蛋白（内质网蛋白）、组蛋白（核蛋白）、GM130（高尔基体蛋白）和细胞色素C（线粒体蛋白）（下图）。

注射安全性：pH 7.2（接近生理值）、渗透压305 mmol/kg（符合注射标准），且无菌、无支原体、无外源性病毒、内毒素小于1 EU/ml（图6）。

图6、EVs溶液的pH、渗透压、无菌、支原体、外源性病毒、内毒素检测结果

EVs的“疗效”依赖于其携带的蛋白质、RNA、脂质等货物种类。研究通过蛋白质组学、小RNA测序、脂质组学深度解析：

蛋白质：5452种蛋白，富集于“神经元投射发育”“血管生成”等功能（图7-A）；

miRNA：416种miRNA，涉及神经发生（65种）、血管生成（153种）等（图7-B）；

脂质：磷脂占比72.6%（包括PC、PS、SM等），胆固醇酯24.0%（图7-C）。

图7、EVs全面多组学分析

更重要的是，三批次EVs的多组学数据一致性>80%，证明生产工艺稳定，为临床应用提供了“可重复”的质量保障。