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HEK293T细胞在Ad60 FBR-AirFlow固定床中无血清培养和外泌体收获工艺研究
发布日期：2025-08-13
HEK293细胞作为生物医药领域的关键工具细胞系，凭借其高转染效率、快速增殖、人类来源的翻译后修饰、可工程化改造及易于规模化生产等优势，在临床应用领域展现出不可替代的价值。工程化HEK293来源外泌体因其低免疫原性、长期稳定性、副作用率低、无伦理争议等优点，在临床肿瘤靶向治理、神经系统疾病治疗、医美应用领域正在爆发其应用潜力。使用生物反应器培养工程化HEK293进行规模化外泌体生产在规模化放大、关键工艺参数控制、质量控制等方面具有优势。
同腾新创（苏州）科技有限公司的核心产品CEL-G® Culture Ad60固定床生物反应器（Ad60 FBR）结合最新推出的AirFlow系列固定床进一步优化流体动力学，显著提升细胞扩增速度及代谢效率，从而提高外泌体产量。本研究基于AirFlow平台，首次系统验证HEK293T细胞无血清连续培养与外泌体收获工艺，旨在为工程化HEK293T来源外泌体的临床级生产提供可放大、可重复的解决方案。
干细胞、免疫细胞治疗与基因编辑技术的快速迭代，正推动“细胞类药品”由早期概念验证走向临床申报与法规监管深水区。今年6月，国家药监局药品审评中心（CDE）发布《先进治疗药品的范围、归类和释义（征求意见稿）》，首次系统界定了细胞治疗药品（CTMPs）在先进治疗药品（ATMP）体系中的分类逻辑、监管准则与准入路径，标志着我国细胞治疗领域首部权威分类指导框架的诞生。尤为关键的是，文件将“具备明确生物学功能”的细胞外囊泡（如外泌体）正式纳入ATMP监管范畴。
凭借低毒性、低免疫原性、优异生物相容性及跨屏障递送能力，外泌体已成为下一代药物递送平台的“潜力股”。然而，临床级外泌体的大规模稳定生产仍是未解难题。现有研究多选用干细胞、肿瘤细胞、HEK细胞或免疫细胞作为供体，但均面临产量、安全性或工艺放大瓶颈。其中，HEK293T细胞（HEK293贴壁亚型）因增殖迅速、产量高、易基因工程化且稳定性佳，被视为外泌体生产的首选细胞。遗憾的是，传统培养依赖血清，引入动物源性污染风险；贴壁培养仍停留在细胞工厂阶段，缺乏符合GMP的大规模放大体系，严重阻碍临床转化。
同腾新创（苏州）科技有限公司的核心产品CEL-G® Culture Ad60固定床生物反应器（Ad60 FBR）专为大规模细胞培养、cGMP级病毒生产及外泌体收获而设计，其独创的“瀑布流”技术可在低剪切力3D环境中实现高密度细胞扩增。最新推出的AirFlow系列固定床进一步优化流体动力学，显著提升细胞扩增效率。本研究基于AirFlow平台，首次系统验证HEK293T细胞无血清连续培养与外泌体收获工艺，旨在为工程化HEK293T来源外泌体的临床级生产提供可放大、可重复的解决方案。
本次工艺研究使用Ad60 FBR BT-2罐体分别搭载AirFlow 0.5m2和1m2固定床（AirFlow FB-0.5R和FB-1R）对HEK293T进行无血清连续培养10天、各收获3次培养上清（表1，图1）。
表1. 设备、固定床载体和主要试剂
图1 AirFlow 固定床外泌体生产收获工艺流程
HEK293T采用HyCloneTM peak expression 无血清培养基在T75瓶中扩增至5.29×108总细胞，细胞活率为99.75%，以相同的细胞总量接种两个规格的固定床，其中FB-0.5R的接种密度为4.9×104/cm2；FB-1R的接种密度为2.6×104/cm2。细胞接种后在两种固定床中均呈现出快速扩增的趋势，其中采用高密度接种的FB-0.5R固定床中细胞生长速度更快，且达到的最高密度更高，而FB-1R固定床中细胞的总数更多（图2a）。FB-0.5R在培养后期的上清中游离细胞水平高于FB-1R，但此时游离细胞的活率维持在80%左右（图2b），反映出膜内外细胞都处于良好的状况。培养结束后，在两种固定床的不同部位取样检测细胞密度，发现载体内部细胞分布均匀（图3）。通过显微镜观察，细胞在T75瓶中2D生长和在固定床载体中3D生长均保持较好的贴壁状态，3D培养时细胞不仅贴附于PET表面，且能在膜内立体空间中均匀分布（图4）
图2 AirFlow FB-0.5/1R HEK293T扩增及游离细胞对比
图3 HEK293T AirFlow FB-0.5/1R 固定床内细胞分布
图4 HEK293T种子细胞扩增及 AirFlow FB-0.5/1R 固定床内生长情况
检测培养过程中的HEK293T细胞生化代谢指标（图5），结果显示FB-0.5R和FB-1R固定床中葡萄糖消耗、乳酸堆积和乳酸脱氢酶LDH释放的代谢表现趋势基本一致，FB-0.5R由于培养后期游离细胞更多，因此LDH水平较FB-1R略高，但整体均小于120U/L，处于较低水平，说明3D培养的细胞的活率高。
图5 HEK293T AirFlow FB-0.5/1R 固定床内代谢对比
本次研究培养10天共收获3次培养上清，采用NTA检测上清中的外泌体颗粒浓度，培养基本底低于1×108Particles/ml，随着细胞扩增两组固定床反应器上清中外泌体颗粒浓度逐步增高，FB-0.5R单产最高为1.4×1010 Particles/ml，FB-1R单产最高达到1.6×1010Particles/ml。
统计三批上清收获的总颗粒数，FB-0.5R共收获4.3 L，外泌体总颗粒数为4.84×1013 Particles，平均单产为1.13×1010 Particles/ml；FB-1R共收获6.4 L，外泌体总颗粒数为 8.84×1013 Particles，平均单产1.38×1010 Particles/ml。
图6 HEK293T AirFlow FB-0.5/1R 固定床外泌体产量对比
本次研究通过在Ad60 FBR最小级别的BT-2反应罐中研究HEK293T细胞培养收获外泌体工艺，证明了AirFlow系列固定床可以提供良好的3D固定化培养环境，细胞不仅可以在无血清条件下迅速扩增，且细胞活性高，代谢表现稳定。上清中外泌体产量平稳上升，从单位颗粒浓度和收获颗粒总数的数据来看，FB-1R的产量更优越，且具备连续收获更多次上清的潜力。该工艺可在Ad60 FBR上进一步放大到FB-8R和FB-24R，预期获得大于2×1015 Particles的外泌体总产量，为工程化HEK293T来源外泌体的临床级生产提供高产量、更安全、可放大的解决方案。
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